【正文】摘   要：超高效液相色谱是近年来发展起来的以超高速度、超高分离度、超高灵敏度为特点的新型液相色谱技术。其应用于复杂体系快速分析所表现出的优势，已引起了药物分析工作者的重视。本文介绍了UPLC的原理及主要特点，并阐述了近年来该技术在药物分析、药物代谢分析和中药质量控制等方面的应用。
　　关键词：超高效液相色谱；药物分析；化学药品；生物药品；中药
　　引言
　　超高效液相色谱（UPLC）仪器的出现，引起了药物分析工作者们广泛的关注。它代表着超高速度、超高分离度、超高灵敏度的UPLC已成为液相色谱的另一个发展方向。虽然UPLC的出现只有短短几年时间，但已经在药物分析领域有了令人注目的表现。本文对UPLC的主要特点及它在药物分析领域的应用做简要的介绍。
　　1.UPLC的原理和优点
　　1.1 UPLC的原理
　　UPLC的分离原理与传统的HPLC相同，由HPLC的速率理论Van Deemter方程可知：色谱分离度随色谱柱填料颗粒粒径的降低而提高。当填料颗粒粒径减小到1.7μm时，理论塔板高度(HETP)最小值区域会扩大许多，即表明1.7μm颗粒粒径可比大颗粒在更宽的流量范围内得到更高的柱效，使得可以在不损失高分离度的前提下优化流速、提高分析速度。UPLC正是通过改变色谱柱填料颗粒粒径来改善柱效，从而使其分离效率和分离速度在HPLC的基础上有了很大的提升。
　　1.2 UPLC的特点
　　小颗粒粒径色谱柱的实际运用有许多技术难点，不但要求仪器在超出目前限度(42MPa)的压力下工作，同时为了不影响梯度洗脱下的性能，要求仪器的系统体积要更小，而且还要求检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。传统液相色谱系统可以承受的最大压力为35～40MaP，而UPLC系统采用了高压流体模型，可以承受的最大压力可达103.5MaP。其二元泵和自动进样器均可在此高压下保持稳定的工作性能，此外自动进样器还具备了进样速度快，进样体积少，交叉污染小，可对受试样品进行温度控制(4～40℃)等特点。UPLC系统可配备光学检测器和质谱检测器。由于低流速下色谱峰扩散小，峰浓度增加，有利于提高离子源的离子化效率，因而使质谱检测器的灵敏度至少提高了3倍。而不论是光学检测器还是质谱检测器，其改进都使UPLC灵敏度的提高、速度的提升成为可能性。总之，UPLC的突出优点在于它的速度和效率都比HPLC系统有了实质性的提升。但是，UPLC在实际应用中也存在一些问题。比如由于进样量过少，且采用半环进样的方式，导致峰面积的重复性略差。而且由于填料颗粒极细，导致UPLC柱易堵塞等。但是随着进样技术、填料技术等进一步发展，这些不足将会得到进一步克服。
　　2.UPLC在药物分析领域的应用
　　2.1 化学药品的分析　
　　应用UPLC分离分析异烟肼、吡嗪酰胺和利福平，采用1.7μm粒径的色谱柱进行梯度洗脱。在柱温为30℃时，3种抗结核药物完全分离时间为2min，而USP方法(HPLC)的分析时间为15min。将柱温提高为90℃时,分析时间则缩短为1min内。在针对药物合成的分析方面，UPLC可实现随时快速准确检测合成过程中的中间体、副产物或降解产物等。Dongre等将UPLC用于磷酸伯氨喹及其异构体和合成中间产物的分离及分析。JurgenMensch等建立了UPLC-MS/MS在药物透析力分析中高通量筛选方法。使用四极杆质谱单体化合物多反应检测(MRM)在正离子模式下检出各种化合物。已确证的化合物包括咖啡因等，其线性范围均在3.05～2 555nmol/L。此方法在缓冲液中检测限为0.61～ 12nmol/L之间。利用UPLC-MS/MS样品处理量提高了4倍，灵敏度显著增加。该方法能成功运用于早期药物筛选。
　　2.2　生化药品的分析　
　　BoogersI等分别利用HPLC和UPLC分析经柱前衍生化处理后的蛋白质水解物中氨基酸。结果表明，两种方法的结果基本一致，但UPLC的分析时间仅为HPLC的40%。MuhammadSaeed等利用UPLC-MS/MS分析经1,2-萘醌或酶活化1,2-二羟基萘与DNA反应后生成腺嘌呤N 3位与鸟嘌呤N 7位的脱嘌呤内收体，探讨了萘诱发肿瘤的机制。经UPLC -MS/MS检测，发现邻醌通过与DNA发生1,4-米氏加合反应是萘与一些芳香族化合物弱致癌作用的普遍机理。
　　2.3中药成分的分析　
　　中药含有大量的生物碱，通常为中药的活性成分，研究这类成分具有重要意义。在采用HPLC法分析生物碱时，由于固定相表面残余硅羟基的影响，此类化合物色谱峰的保留行为会发生变化，造成色谱峰严重展宽和拖尾，因而在分析时常需要在流动相中加入添加剂，如离子对试剂、有机胺类等，用以屏蔽固定相表面残余硅羟基的作用，但这些添加剂的加入往往会给LC-MS联用带来不便。Waters公司合成了1.7μm颗粒度的AcquityUPLC填料，减少了固定相表面残余硅羟基，因而在分析生物碱类样品时，流动相中只加入酸抑制剂，不需添加有机胺即可使其获得良好的分离。由于在流动相中避免了有机胺及盐的加入，可以在一定程度上降低质谱噪音、减少对质谱的污染，且使用的流速适合与质谱直接联用，无需分流，可以进一步提高检测灵敏度，为中药分析提供良好的平台。ChenJ等采用UPLC和HPLC方法对丹参药材中丹酚酸B含量测定结果进行了对比，两种方法的含量测定结果一致。UPLC能够替代HPLC测定丹参药材中丹酚酸B含量，既加快了分析速度，达到了样品分析的高通量，减少有机溶剂的使用，又得到更高的分析灵敏度。
　　2.4　药物代谢动力学研究　
　　药物代谢动力学涉及药物在肌体内吸收、分布、代谢和排泄过程的研究，包括药物及其在各种复杂基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中代谢物的分离、结构鉴定以及痕量分析测定。肌体的体液系统中存在大量的保留时间相同、相对分子质量也相同的干扰组分；而目前药物研制日趋低剂量，使常规的分离检测技术难以满足复杂介质中痕量成分准确定量的要求。能否在复杂的体液系统中快速检测和鉴定出药物的代谢产物，依赖于高效的色谱分离和灵敏的高分辨质谱技术的联用。采用UPLC-MS联用技术进行药物代谢及药物动力学研究，体现了其高灵敏度和高专属性特点，而且能够同时测定样品中复方制剂的多组分浓度,实现样品高通量分析。
　　2.4.1化学药品代谢产物的分析　
　　DasandiB等建立了UPLC-MS/MS定量测定人血浆中喹那普利和喹那普利特的方法，采用AcquityBEH C18色谱柱(100mm×2.1mm, 1.7μm)，以赖诺普利为内标，喹那普利和喹那普利特线性范围分别为5.010～500.374ng/ml和10.012～1000ng/ml，定量限分别为5.010ng/ml和10.012ng/ml。日内和日间精密度的RSD均小于10%，喹那普利、喹那普利特和赖诺普利的回收率分别为85.8%、62.6%和61.3%，样品的分析时间仅需3min。BhaveshD等利用UPLC-MS测定人血浆中非诺贝酸含量，以甲芬那酸为内标，线性范围为0.05～7.129mg/ml，定量限为0.05mg/ml，日内和日间精密度均小于9.3%，非诺贝酸和甲芬那酸的提取回收率分别为66.7%和52.6%，样品分析时间仅为1.8min。YunshengH等比较了各种快速液相色谱与质谱串联技术，同时检测大鼠血浆中低剂量(ng/ml)克拉屈滨和克罗拉滨含量的方法。得出结论为UPLC-MS/MS较HPLC-MS/MS方法，具有更高的灵敏度、更好的分离度、更快的速度、更高的经济价值及可靠性，同时也能避免母离子抑制效益。
　　2.4.2中药代谢产物的分析　
　　随着天然药化、中药药理、中药分析等相关学科的发展，中药药物代谢动力学科逐渐成为现代中药学科研究的重要内容之一。由于中药组分复杂，有效成分多样化且含量低，UPLC具有高分离度，高灵敏度等优点，近年来越来越多的研究者采用UPLC-MS/MS技术研究中药化学成分的体内代谢转化。
　　3展望
　　随着UPLC的快速应用和推广，其已在药物分析领域中充分展示了其优越性，具有广阔的应用前景。其进样体积小，分离快，溶剂消耗少，为药物化学成分分析、药物合成分析、中药快速定性定量分析和体内代谢产物分析提供了一种高效、准确的分析技术。充分利用UPLC的高分离效率和MS的高灵敏度与定性功能，能快速完成众多复杂成分的分离与鉴定，该联用技术既可建立中药或复方药物指纹图谱，又可进行多种有效成分或指标成分定量，还可用于体内药物分析。
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